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第二代DNA测序技术

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发表于 2016-6-14 10:26:40 | 显示全部楼层 |阅读模式
摘要:近年来生命科学的发展迫切需要费用更低、通量更高、速度更快的DNA测序技术,第二代测序技术便应运而生。本文重点论述第二代测序技术的产生背景、主要原理和现有的三大技术平台,并介绍了基于第二代DNA测序技术而产生的生物研究的新领域。
在基因解读的病例中,我们时常会看见一个词“二代基因检测”,今天就简单的了解一下什么是二代基因检测。
DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术,在生物学研究中有着广泛的应用。第一代DNA测序技术是1977年Sanger发明的末端终止测序法,其法因为既简便又快速,并经过不断改良,成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展,传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche/454 FLXPyrosequencer、Illumina GenomeAnalyzer和AppliedBiosystems SOLiDTM Sequencer这三个技术平台。及在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。
首先,Roche/454 FLXPyrosequencer的测序片段比较长,高质量的读长(read)能达到400 bp,其原理是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下,将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来,通过检测化学发光信号的有无和强度,达到实时检测DNA序列的目的。其次,Solexa测序性价比最高,不仅机器的售价比其他两种低,而且运行成本也低。Illumina GenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序,具体的说是将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flow cell),这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在Flow cell上形成了数以亿计Cluster,每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇,然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。第三,SOLiD测序的准确度高,是目前第二代测序技术中准确度最高的。它的原理是用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列,随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列,把SOLiD颜色序列定位到reference上,同时校正测序错误,并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。
在第二代DNA测序技术平台的推动下,一些生物学研究的新领域逐步涌现。真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在,因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。基于新一代测序技术,科学家利用染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)技术来阐明DNA与蛋白质的相互作用。ChIP技术是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。ChIP技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。ChIP技术的原理是结合新一代的高通量测序技术,在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,超声波将染色质打碎后,用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息,还可以获得全基因组范围内组蛋白各种修饰状态、转录因子结合位点的高分辨率分布图。
早期用于mRNA表达研究有qPCR和基因芯片技术,但是由于昂贵的DNA测序费用以及测定速度慢和规模小而限制其使用范围。目前,在基因芯片的基础上,基因表达系列分析(Serial Analysisof Gene Expression,SAGE)技术被大量用于高通量基因研究。基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因,放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱;相比之下,SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测基因表达谱的改变,而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。因此在检测新基因,特别是无法用基因芯片进行检测的低丰度基因时,SAGE是目前的最佳手段,无可取代。
第二代测序技术通过RNA深度测序可以发现一些平常很难发现的RNA剪接形式,从而发现更为准确的基因表达信息。高通量测序还被广泛应用于非编码RNA研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题,同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。新一代测序技术在研究化石DNA方面也显示出来强大的作用。此外,新一代测序技术的出现也为宏基因组学的研究提供了平台。
新一代测序已显示出巨大的潜力。随着技术的不断进步,这一技术将会在越来越多的领域内显示其巨大的力量。

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